最后使用封口胶将塑料袋边缘密封，从而形成一个完整的转膜三明治结构。将此三明治放入转移装置，如半干转膜仪或湿转膜仪，按照设定的电压或电流参数进行转移。转膜结束后取出，剥离滤纸，晾干NC膜并检测效果。
转膜的三明治顺序是什么？
为了进一步裂解细胞并降低样品粘度，需要进行超声处理。设置超声仪频率与功率，探头置于样本中部不触碰管壁，采用超声3秒、暂停10秒的循环，重复3-5次，总时长10-15秒。超声后样品需再次置于冰上孵育30分钟。
最后，将裂解样品在4℃条件下以12000rpm离心15-20分钟，吸取上清液至新EP管中，置于冰上备用。这一过程能有效去除细胞碎片，获得含有目标蛋白的上清液，为后续的转膜检测提供高质量样本。
在匀浆器中加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，比例为每20mg组织加150-250ul裂解液。置于冰上研磨2-5分钟至无肉眼可见团块，随后冰浴裂解30分钟，使细胞充分裂解。这一步骤有助于释放细胞内的蛋白质。
接下来处理滤纸，将其浸入转膜缓冲液充分湿润后，平铺在凝胶上，务必确保滤纸与凝胶表面紧密接触，避免中间有空隙影响电流传导和蛋白转移效率。随后放置NC膜，使其覆盖在滤纸上，并紧贴滤纸表面。
转膜三明治的构建顺序非常关键，首先需准备好凝胶、转膜缓冲液、滤纸、硝酸纤维素膜（NC膜）及封口胶等材料。接着配制包含甲醇、乙酸和甘油的转膜缓冲液，将凝胶放入其中湿润，注意保持湿润但不能过度浸泡，这是为了保证凝胶的状态适合后续转移。
除了转膜步骤，蛋白提取也是实验的重要一环。以组织样蛋白提取为例，需准备RIPA裂解液、PBS、匀浆器、离心机等。首先取50-100mg新鲜组织，用预冷PBS洗涤干净后剪成小块，放入2ml离心管中。
在放置NC膜时，为了排除可能产生的气泡，可以用手指或滚轮在NC膜上轻轻滚动，确保膜与下层材料之间没有气泡残留，这对于转膜的成功至关重要。然后取含有转移缓冲液的塑料袋覆盖在NC膜上，确保袋边缘与膜紧密贴合。